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視網(wǎng)膜是高度依賴氧供的神經(jīng)組織，其代謝活性高且血管分布特殊，一旦氧供失衡便會(huì)引發(fā)一系列病理損傷，最終導(dǎo)致視力下降甚至失明。視網(wǎng)膜低氧疾病涵蓋早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、糖尿病視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜靜脈阻塞等多種臨床常見疾病，其核心病理環(huán)節(jié)涉及神經(jīng)細(xì)胞凋亡、血管新生紊亂及炎癥反應(yīng)激活。構(gòu)建貼近體內(nèi)病理狀態(tài)的低氧實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，是解析疾病發(fā)病機(jī)制、開發(fā)新型治療策略的關(guān)鍵前提。

傳統(tǒng)低氧培養(yǎng)方法多依賴密封容器或缺氧袋，存在氧濃度調(diào)控精度低、穩(wěn)定性差、無法長(zhǎng)期維持等缺陷，難以模擬視網(wǎng)膜低氧疾病的動(dòng)態(tài)病理過程。三氣培養(yǎng)箱作為體外細(xì)胞與組織培養(yǎng)的核心設(shè)備，通過精準(zhǔn)調(diào)控氧氣（O?）、二氧化碳（CO?）及氮?dú)猓∟?）的比例，可構(gòu)建穩(wěn)定的低氧微環(huán)境，為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域疾病模型的構(gòu)建提供技術(shù)支撐。博清生物三氣培養(yǎng)箱憑借其高精度控氧系統(tǒng)、穩(wěn)定的溫濕度控制及智能化操作優(yōu)勢(shì)，在低氧相關(guān)疾病研究中展現(xiàn)出獨(dú)特應(yīng)用潛力。

一、材料與方法

（一）實(shí)驗(yàn)材料

1、細(xì)胞與組織：SD大鼠原代視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞（出生后3天大鼠）、人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞系（ARPE-19）；

2、主要設(shè)備：博清生物三氣培養(yǎng)箱、倒置熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、電泳系統(tǒng)；

3、試劑：DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、CCK-8試劑盒、Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒、VEGF及HIF-1α抗體、相關(guān)引物等。

（二）實(shí)驗(yàn)分組

1、正常氧組（對(duì)照組）：O?濃度21%，CO?濃度5%，溫度37℃；

2、低氧模型組（實(shí)驗(yàn)組）：通過博清生物三氣培養(yǎng)箱設(shè)置O?濃度5%（生理性低氧）、1%（病理性低氧），CO?濃度5%，溫度37℃，分別培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)（24h、48h、72h）。

（三）低氧模型構(gòu)建

1、細(xì)胞培養(yǎng)：將原代視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞及ARPE-19細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁后，轉(zhuǎn)移至博清生物三氣培養(yǎng)箱中進(jìn)行分組培養(yǎng)。設(shè)備通過紅外傳感器實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)氧濃度，精度達(dá)±0.1%，并自動(dòng)調(diào)節(jié)N?與O?比例，確保低氧環(huán)境穩(wěn)定；

2、原代組織培養(yǎng)：分離大鼠視網(wǎng)膜組織，切成1mm3大小的組織塊，置于Transwell小室中，在博清三氣培養(yǎng)箱的低氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)基。

（四）檢測(cè)指標(biāo)與方法

1、細(xì)胞活力檢測(cè)：采用CCK-8法，檢測(cè)不同低氧條件下細(xì)胞在各時(shí)間點(diǎn)的吸光度值（OD450nm）；

2、細(xì)胞凋亡檢測(cè)：通過Annexin V-FITC/PI雙染法，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率；

3、分子表達(dá)檢測(cè)：實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)VEGF、HIF-1α的mRNA表達(dá)水平；Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)量；

4、組織形態(tài)觀察：倒置熒光顯微鏡觀察原代視網(wǎng)膜組織的形態(tài)完整性及細(xì)胞存活狀態(tài)。

二、結(jié)果

（一）博清生物三氣培養(yǎng)箱的低氧環(huán)境穩(wěn)定性驗(yàn)證

博清生物三氣培養(yǎng)箱在設(shè)定5%及1%氧濃度后，可在30分鐘內(nèi)達(dá)到目標(biāo)氧濃度并穩(wěn)定維持。連續(xù)72小時(shí)監(jiān)測(cè)顯示，氧濃度波動(dòng)范圍≤±0.2%，CO?濃度穩(wěn)定在5.0%±0.1%，溫度波動(dòng)≤±0.1℃，顯著優(yōu)于傳統(tǒng)低氧培養(yǎng)方法的穩(wěn)定性（傳統(tǒng)方法氧濃度波動(dòng)范圍±1.0%）。

（二）低氧對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞活力與凋亡的影響

1、細(xì)胞活力：與對(duì)照組（21% O?）相比，5%低氧組細(xì)胞在24h、48h、72h的活力無顯著下降（P>0.05）；1%低氧組細(xì)胞活力隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低，72h時(shí)OD值降至對(duì)照組的62.3%±4.1%（P<0.01）；

2、細(xì)胞凋亡：1%低氧組細(xì)胞凋亡率顯著升高，72h時(shí)凋亡率達(dá)31.2%±3.5%，顯著高于對(duì)照組的5.8%±1.2%（P<0.01）；5%低氧組凋亡率無明顯變化（P>0.05）。

（三）低氧對(duì)VEGF及HIF-1α表達(dá)的調(diào)控作用

1、mRNA水平：1%低氧組VEGF及HIF-1α的mRNA表達(dá)量在24h開始升高，48h達(dá)峰值，分別為對(duì)照組的3.8倍±0.5倍和4.2倍±0.6倍（P<0.01）；

2、蛋白水平：Western blot結(jié)果顯示，1%低氧組VEGF及HIF-1α蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)，與mRNA表達(dá)趨勢(shì)一致。

（四）原代視網(wǎng)膜組織的低氧培養(yǎng)效果

在博清生物三氣培養(yǎng)箱1%低氧條件下，原代視網(wǎng)膜組織可維持形態(tài)完整性達(dá)72h，組織邊緣細(xì)胞存活狀態(tài)良好；而傳統(tǒng)低氧培養(yǎng)條件下，組織在48h后出現(xiàn)明顯崩解，細(xì)胞脫落顯著。

三、討論

視網(wǎng)膜低氧疾病的病理機(jī)制研究高度依賴穩(wěn)定、可控的體外低氧模型，而氧濃度的精準(zhǔn)調(diào)控是模型構(gòu)建的核心技術(shù)要求。博清生物三氣培養(yǎng)箱通過采用高精度紅外氧傳感器與智能氣體混合系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了氧濃度從1%到21%的連續(xù)可調(diào)，且波動(dòng)范圍極小，有效解決了傳統(tǒng)低氧培養(yǎng)中氧濃度不穩(wěn)定、無法模擬動(dòng)態(tài)病理過程的難題。

本研究發(fā)現(xiàn)，病理性低氧（1% O?）可顯著誘導(dǎo)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡，同時(shí)上調(diào)VEGF及HIF-1α的表達(dá)，這與體內(nèi)視網(wǎng)膜低氧疾病的病理特征一致。HIF-1α作為低氧應(yīng)激的核心調(diào)控因子，其激活后可促進(jìn)VEGF轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而引發(fā)血管新生紊亂，這一機(jī)制在糖尿病視網(wǎng)膜病變等疾病的進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。博清生物三氣培養(yǎng)箱構(gòu)建的低氧模型能夠精準(zhǔn)復(fù)現(xiàn)這一病理過程，為相關(guān)分子機(jī)制的深入研究提供了可靠平臺(tái)。

此外，該設(shè)備對(duì)溫度、CO?濃度的精準(zhǔn)控制，確保了細(xì)胞與原代組織的生理活性，使原代視網(wǎng)膜組織在低氧條件下仍能維持形態(tài)完整性達(dá)72h，為組織水平的低氧損傷研究提供了可能。與傳統(tǒng)培養(yǎng)設(shè)備相比，博清生物三氣培養(yǎng)箱的智能化操作的便捷性，可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)并記錄培養(yǎng)環(huán)境參數(shù)，進(jìn)一步提升了實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性與數(shù)據(jù)可靠性。

本研究也存在一定局限性，后續(xù)可利用該設(shè)備探究不同低氧梯度、不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞及組織的影響，結(jié)合多組學(xué)技術(shù)解析低氧相關(guān)的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。同時(shí)，可基于該模型開展?jié)撛谥委熕幬锏暮Y選與評(píng)價(jià)，為視網(wǎng)膜低氧疾病的臨床治療提供新的思路。

博清生物三氣培養(yǎng)箱憑借其精準(zhǔn)的氧濃度調(diào)控能力、穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境及可靠的操作性能，成功構(gòu)建了貼近體內(nèi)病理狀態(tài)的視網(wǎng)膜低氧細(xì)胞與組織模型。該設(shè)備可有效模擬視網(wǎng)膜低氧疾病的核心病理過程，為低氧相關(guān)分子機(jī)制研究、細(xì)胞功能分析及原代組織培養(yǎng)提供了關(guān)鍵技術(shù)支撐。研究證實(shí)，博清生物三氣培養(yǎng)箱在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的視網(wǎng)膜低氧疾病研究中具有重要應(yīng)用價(jià)值，有望成為相關(guān)疾病機(jī)制探索與藥物研發(fā)的核心實(shí)驗(yàn)設(shè)備。